Percobaan 2

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Kata Pengantar

            Mikroorganisme hidup tersebar luas. Mereka bisa hidup di dalam tanah, air, dan udara bahkan di dalam tubuh manusia. Di samping itu ragam jenis mikroba juga sangat banyak dan memiliki variasi yang cukup besar. Hal tersebut memberikan suatu peluang penggalian serta pemanfaatan potensi mikroba.

Mikroorganisme yang ada sekarang begitu banyak terjamah oleh peneliti. Masih banyak spesies mikroba yang belum dikenali. Bahkan komposisi mikroba dalam kolon (usus besar) kita sendiri baru selesai dikenali sebesar 20-30% saja. Sisanya masih dalam tahap penyelidikan. Besar harapan ditemukan spesies mikroba yang memiliki sifat-sifat yang menguntungkan bagi kehidupan manusia. Selain untuk mengungkap potensi mikroba yang menguntungkan, kita juga harus bisa mengungkapkan varian mikroba pencetus penyakit dan cara penanganannya. Semua demi kesejahteraan manusia.

1.2. Tujuan Percobaan

            Tujuan dari percobaan ini adalah mempelajari perbedaan morfologi dari masing-masing sel mikroba dan untuk mengetahui jumlah mikroba dalam suatu sampel.

BAB II

DASAR TEORI

Kata morfologi berarti ilmu mengenai bentuk dan struktur. Karena itu, studi tentang bakteri kita mulai dengan tujuan terhadap berbagai bentuk sel bakteri. Pada umumnya dikenal tiga bentuk yang berbeda; oleh sebab itu berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga kelompok utama:

1.      Kokus – bulat.

2.      Basil – berbentuk silinder atau batang.

3.      Spiral – batang melengkung atau melingkar-lingkar.

 (Volk dan Wheeler, 1993)

Bakteri berasal dari kata ”bakterion” (bahasa Yunani) yang berarti tongkat atau batang. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berbiak dengan pembelahan diri, serta demikian kecilnya sehingga hanya tampak dengan mikroskop (Dwidjoseputro, 1994).

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat atau diteliti sekalipun di bawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikroba yang tidak mempunyai zat warna seperti umumnya yang didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang jelas mempunyai butir-butir/serat warna dalam selnya (Waluyo, 2005).

Teknik pewarnaan differensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri adalah pewarnaan gram. Pada proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan ungu kristal, larutan iodium, alkohol (bahan pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu bakteri gram positif yang mempertahankan warna ungu tua. Sedangkan bakteri lain yaitu bakteri gram negatif yang kehilangan warna ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna merah safranin tampak bewarna merah (Gaman, 1994).

Pewarnaan Gram merupakan metode pewarnaan yang sangat dikenal luas terhadap pengamatan bakteri. Bakteri diberi perlakuan dengan serangkaian pengecatan. Pertama, pemberian cat Gram A yaitu crystal violet sebagai pewarna pembuka. Kedua, pemberian cat Gram B yaitu lugol iodine. Kemudian, melakukan pencucian dengan zat pelarut (dekolorisasi) dari cat Gram C yaitu aseton alcohol. Perlakuan terakhir dengan pemberian zat warna penutup yaitu safranin. Pada masing-masing perlakuan, terlihat adanya reaksi yang berbeda dari membran sel bakteri (Sutedjo, 1996).

            Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, “Most Propable Number” (MPN), dan metode hiutngan mikroskopik langsung. Metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Metode lainnya adalah metode turbudimetri (kekeruhan) menggunakan spektofotometer. Tetapi metode ini sukar ditetapkan pada bahan pangan karena medium yang diukur harus bening, sedangkan ekstrak bahan pangan, misalnya sari buah, biasanya mengandung komponen-komponen yang menyebabkan kekeruhan larutan tidak sebanding dengan jumlah mikroba yang terdapat di dalamnya  (Fardiaz, 1993).

Prinsip metode hitungan cawan adalah sebagai berikut: jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan sebagai berikut:

1.      Hanya sel yang masih hidup yang dihitung.

2.      Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus.

3.      Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakkan pertumbuhan spesifik  (Fardiaz, 1993).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

            Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, 11 November 2011, pukul 16.00 - 18.00 WITA, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru.

3.2. Alat dan Bahan

            Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah mikroskop, botol semprot, pipet tetes, jarum ose (lup inokulasi), bunsen, gelas benda dan penutup.

            Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah cat gram a (kristal violet), cat gram B (lugol iodine), cat gram C (Aseton-alkohol), safranin, methylen blue, laktofenol blue, biakan-biakan bakteri (Bacillus subtilis, Escherichia coli), dan air sumur.

3.3.  Prosedur Kerja

3.3.1.  Pengecatan Gram Bakteri

1.      Menyiapkan mikroskop, serta membersihkan gelas benda dan gelas penutup

2.      Mengambil biakan bakteri (sesedikit mungkin) dengan jarum ose

3.      Meratakan setipis mungkin di bagian tengah gelas benda dan fiksasi suspensi

4.      Membubuhkan cat gram A (crystal violet) sampai menutup seluruh suspensi bakteri. Membiarkan satu menit dan mencuci dengan botol semprot serta kering-anginkan.

5.      Membubuhkan cat gram B (Lugol Iodine) kemudian membiarkan selama satu menit. Mencuci dengan botol semprot, kemudian kering-anginkan

6.      Mentetesi dengan cat gram C (aseton alkohol), lalu membiarkan selama 30 detik. Mencuci dengan botol semprot, kemudian kering-anginkan

7.      Mentetesi dengan cat gram D (safranin), kemudian membiarkan selama satu menit. Setelah itu mencuci dan kering-anginkan

8.      Menutup dengan gelas penutup, lalu mengamatinya di bawah mikroskop

9.      Menggambar penampakan sel bakteri yang terlihat pada mikroskop

3.3.2 Pengenceran

1.      Menyediakan 3 tabung reaksi.

2.      Mengisi tabung reaksi dengan 9 mL NaCl.

3.      Menambahkan dengan 1 mL air sumur  menggunakan pipet Eppendort.

4.      Mengambil 1 mL larutan dari tabung reaksi satu kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2.dilakukan juga hal yang sama pada tabung reaksi 3.

5.      Memasukkan biakan ke dalam cawan petri untuk dihitung koloninya.

3.3.3 Penghitungan koloni

1.      Melakukan biakan bakteri.

2.      Meletakkan biakan di cawan petri.

3.      Menghitung koloni bakteri setelah menunggu selama 60 jam.

4.      Melakukan perhitungan bakteri dengan menggunakan colony counter.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel 1. Pengecatan Sel Mikroba

No.	Gambar	Keterangan
1. 2.	Gambar 1. E. coli Gambar 2. B. subtilis	Gram     : Negatif Bentuk   : Bulat Warna    : Merah Perbesaran  : 400 X Gram     : Positif Bentuk   : Batang Warna    : Ungu Perbesaran  : 100 X

Tabel 2. Perhitungan Mikroba Dengan Coloni Counter

No.	Pengenceran	Jumlah Koloni	Gambar
1 2. 3.	10-1 10-1d 10-1t 10-2 10-2d 10-2t 10-3 10-3d 10-3t	18 18 57 2 1 10 15 2 8

4.2. Pembahasan

  Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras bewarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat lebih jelas (Sutedjo, 1991).

Pewarnaan sel bakteri ini dapat menyebabkan dua kemungkinan yaitu bakteri bersifat gram positif dan gram negatif tergantung pada responnya bila diwarnai dengan pewarnaan bakteri menurut gram. Kadar lipid dalam sel bakteri gram negatif lebih besar dibanding sel bakteri gram positif. Bakteri gram positif mempunyai susunan dinding sel yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel lebih besar, sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks ungu kristal-Iodium.

Serangkaian pewarnaan yang dilakukan pada sel bakteri dengan memberikan zat pewarna pertama samapai zat pewarna penutup memberikan fungsinya masing-masing. Cat gram A (crystal violet) berfungsi untuk memberikan warna ungu pada biakan karena zat warna diserap dalam dinding sel dan sitoplasma. Cat gram B (lugol iodine), zat ini bewarna coklat yang menyebabkan terbentuknya kompleks ungu kristal-iodium dan untuk memfiksasi zat warna yang sudah diserap sehingga lebih kuat pengikatannya. Cat gram C (aseton alkohol), zat ini tidak bewarna yang berfungsi untuk melunturkan zat warna sebelumnya yang diserap mikroba, pencucian dengan alkohol menyebabkan terjadinya diferensiasi dan dua macam bakteri yaitu, bakteri akan tetap bewarna ungu karena tahan terhadap pemberian alkohol atau bakteri tidak bewarna karena tidak tahan terhadap pemberian alkohol sehingga zat warna dilunturkan (larut) dan keluar dari sel bakteri. Cat gram D (safranin) sebagai pewarna kontras, zat ini bewarna merah untuk memberikan warna pada bakteri yang tidak bewarna. Jika bakteri sudah tidak lagi menyerap atau mengikt cat gram D (safranin) karena bakteri tersebut sudah jenuh mengikat cat gram A (crystal violet) yang bewarna ungu maka bakteri tersebut bersifat sebagai bakteri gram positif. Sedangkan bakteri gram negatif adalah jika bakteri mengikat cat gram D (safrnain) yang bewarna merah karena zat warna sebelumnya sudah luntur akibat pencucian dengan alkohol.

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan Bakteri Escherichia coli bersifat gram negatif karena tidak dapat mempertahankan warna ungu sehingga luntur pada saat pencucian dengan alkohol, karena bakteri ini tidak tahan terhadap asam dan kemudian bakteri tersebut mengikat zat warna safranin sehingga bewarna merah. Morfologi bakteri Escherichia coli yang didapat dari hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop adalah berbentuk kokus (bulat) yang tidak beraturan dan tampak bewarna merah. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop, bakteri E. Coli termasuk gram negatif yang ditunjukkan dengan adanya warna merah, dan memiliki bentuk bulat. Bacillus subtilis termasuk gram positif, hal ini ditunjukkan dengan adanya warna ungu, dan berbentuk batang.

Perbedaan relatif dari bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif adalah struktur dinding sel Gram positif sekitar 15-80 nm dan berlapis tunggal sedangkan Gram negatif lebih tipis yaitu sekitar 10-15 nm dan berlapis tiga. Komposisi dinding sel Gram positif memiliki kandungan lipid rendah (1-4%) dan Gram negatif lebih tinggi (11-22%). Gram positif lebih rentan terhadap penisilin dibandingkan dengan Gram negatif. Pertumbuhan Gram positif dihambat oleh zat-zat warna dasar misalnya ungu kristal sedangkan Gram negatif tidak begitu dihambat. Persyaratan nutrisi Gram positif relatif rumit pada banyak spesies sedangkan Gram negatif relatif sederhana. Gram positif lebih resisten terhadap gangguan fisik dibandingkan Gram negatif.

            Pengenceran juga dilakukan pada percobaan ini. Pengenceran ini dilakukan menggunakan tabung reaksi sebagai wadah pengenceran. Sampel yang telah diencerkan tadi kemudian dipindahkan ke cawan petri dan diinkubasi selama 60 jam, dimana dihasilkan koloni duplo dan triplo setelah dilakukan penghitungan pada coloni counter. Adapun hasil perhitungan koloni untuk sampel yang pertama pada 10^-1 terhitung ada 18 koloni, untuk diplonya terhitung 18 koloni, serta untuk triplonya terhitung ada 57 koloni. Hasil perhitungan untuk sampel yang kedua pada 10^-2 terhitung 2 koloni, untuk diplo 1 koloni dan triplonya 10 koloni. Sedangkan untuk sampel yang ketiga 10^-3 terhitung 15 koloni, untuk diplo 2 koloni dan triplonya ada 8 koloni.

BAB V

PENUTUP

5.1   Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari ercobaan ini yaitu:

1.      Bakteri gram positif yaitu bakteri yang memberi warna ungu atau biru setelah melalui serangkaian pengecatan gram.

2.      Bakteri gram negatif adalah bakteri yang memberi warna merah atau merah muda setelah melalui serangkaian proses pngecatan gram.

3.         Bakteri E. Coli termasuk bakteri gram negatif dengan bentuk sel bulat (coccus) .

4.      Bakteri Bacillus subtilis termasuk gram positif dengan bentuk sel batang (basil).

5.2 Saran

Beberapa saran yang dapat disampaikan dalam percobaan ini adalah  sebaiknya hati-hati dalam memindahkan biakan mikroba apalagi kalau biakan mikroba yang digunakan bersifat patogen.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta

Gaman, P. M. et. All. 1994. Ilmu Pangan Edisi Kedua. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Sutedjo, M. M. Kartasapoetra dan Sastraatmodjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta

Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar jilid 1, Erlangga, Jakarta.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.